1.Beurteilende(r)| Name: | O.Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.nat.techn. Hermann Katinger |
| Herkunftsbetrieb: | |
| Arbeit |
| Typ der Arbeit: | Dissertation |
| Sprache der Arbeit: | Englisch |
| Titel der Arbeit in Originalsprache: | Biochemical Characterization of the murine ADAMTS13 (Von Willebrand Factor-Cleaving Protease, VW-cp) and ADAMTS13 silencing with small interfering RNA |
| Titel der Arbeit in deutsch: | n.a. |
| Titel der Arbeit in englisch: | Biochemical Characterization of the murine ADAMTS13 (Von Willebrand Factor-Cleaving Protease, VWF-cp) and ADAMTS13 silencing with small interfering RNA |
| Publikationsmonat: | 03.2006 |
| Seitenanzahl: | |
| Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur |
| AC-Nummer: | AC05032063 |
| Abstract |
| Abstract in Deutsch: | Funktionelle Defizienz oder Fehlen der humanen von Willebrand Factor (VWF)-cleaving protease (VWF-cp) oder ADAMTS13 stehen im Zusammenhang mit erworbener und angeborener thrombotisch-thrombozytopenischer Purpura (TTP), einer lebensbedrohlichen Blutgerrinungsstörug. Um die Entwicklung eines Tiermodells für TTP zu ermöglichen, wurde die komplette murine ADAMTS13 (mADAMTS13) cDNA aus poly-A+ RNA einer BALB/c-Mausleber kloniert. Murine ADAMTS13 weist eine hohen Homologie zum humanen Ortholog und einen ähnlichen strukturellen Aufbau auf. Mittels rekombinanter eukaryontischer Expression der murinen ADAMTS13 cDNA in HEK 293 und CHO Zellen wurde ein Protein von ca. 180kD gewonnen, dessen Fähigkeit VWF zu schneiden von EDTA (Metalloproteasehemmer), Plasma von Patienten mit erworbener TTP und Ziegen- oder Kaninchen-Antikörpern gegen humane ADAMTS13 inhibiert wurde. Weiters wurde wurde eine Substratpräferenz von muriner ADAMTS13 zu murinem VWF gegenüber humanen VWF festgestellt, während humane ADAMTS13 beide VWF Orthologe mit gleicher Effizienz schneidet. Mittels Expressionsanalyse wurde, ähnlich wie bei humaner ADAMTS13, die Leber als Hauptexpressionsorgan für Adamts13 mRNA identifiziert. Mit "small interfering RNA" (siRNA) konnte die rekombinante Expression der mADAMTS13 in Säugetierzelllinien, die stabil mADAMTS13 expremieren, unterdrückt werden. Um mit dieser siRNA ein Tiermodell für erworbene TTP oder andere Krankheiten, die mit schwerer oder moderater ADAMTS13 Defizienz einhergehen, zu entwickeln, wurde Mäusen ADAMTS13-siRNA verabreicht und deren endogene ADAMTS13 Expression getestet. Die verwendete Methode der Administration ("hydrodynamic tail-vein injection") führte allerdings nicht zur erwarteten Aufnahme der siRNA und zur Reduktion der ADAMTS13 Aktivität im Mausplasma oder zur Verringerung der Adamts13 mRNA Konzentration in Mausleber. Mit alternativen Methoden der Administration wie Endozytose-mediierte Aufnahme von Ligand-gekoppelter siRNA können die funktionellen siRNAs zur Entwicklung eines transientes TTP Tiermodells beitragen. |
| Abstract in Englisch: | Functional deficiency or absence of the human von Willebrand Factor (VWF)-cleaving protease (VWF-cp), recently termed ADAMTS13, has been shown to be involved in acquired and congenital thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) a life threatening disease. As a first step towards developing a small animal model of TTP, we have cloned the complete murine ADAMTS13 (mADAMTS13) cDNA from BALB/c mice liver poly-A+ mRNA. Murine ADAMTS13 shows a high homology to and similar structural organization as the human ortholog. Recombinant eukaryotic expression of the murine ADAMTS13 cDNA in HEK 293 and CHO cells yielded a protein with a molecular weight of approximately 180kD whose VWF proteolysis capability was inhibited by the addition of EDTA, the plasma from acquired TTP patients and purified goat or rabbit IgG against human ADAMTS13. mADAMTS13 showed a substrate preference towards murine VWF compared to human VWF, whereas human ADAMTS13 (hADAMTS13) cleaved human or murine VWF with the same efficiency. Expression analysis revealed the liver to be the main expression tissue for Adamts13 mRNA, similar to human ADAMTS13.
Using small interfering RNA (siRNA) recombinant expression of mADAMTS13 was suppressed in stably mADAMTS13 expressing HEK 293 and CHO cells. In order to develop an animal model mimicking the phenotype of patients suffering from acquired TTP or other diseases associated with severe or moderate deficiency of ADAMTS13, ADAMTS13-siRNA was administered to mice. However, using hydrodynamic tail vein injection as administration technique, the expected in vivo knockdown of endogenous ADAMTS13 in mouse plasma or liver was not induced. Nevertheless, using alternative strategies of siRNA delivery such as endocytosis-mediated uptake of ligand-conjugated siRNA, those functional siRNAs could contribute to the development of a transient TTP animal model.
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| Schlagworte |
| Schlagwörter Deutsch: | Genetik ADAMTS13 RNAi siRNA Von Willebrand Factor |
| Schlagwörter Englisch: | BIOLOGY, GENETICS von Willebrand Factor ADAMTS13 siRNA RNAi |
| Sonstiges |
| Signatur: | HB: D-12512 |
| Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H79100 Institut für Bioverfahrenstechnik |
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