| AutorIn | | Name: | DIPL.-ING. Christina Nicole Ganster | Beurteilende(r)| Name: | Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.techn. Dietmar Haltrich | | Herkunftsbetrieb: | | | Arbeit | | Typ der Arbeit: | Masterarbeit | | Sprache der Arbeit: | Englisch | | Titel der Arbeit in Originalsprache: | Characterisation of newly found Cellobiose Dehydrogenases from Ceriporiopsis subvermispora and Myriococcum thermophilum combining methods from biochemistry, molecular biology and bioinformatics | | Titel der Arbeit in deutsch: | n.a. | | Titel der Arbeit in englisch: | Characterisation of newly found Cellobiose Dehydrogenases from Ceriporiopsis subvermispora and Myriococcum thermophilum combining methods from biochemistry, molecular biology and bioinformatics | | Publikationsmonat: | 09.2005 | | Seitenanzahl: | | | Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur | | AC-Nummer: | AC04713235 | | Abstract | | Abstract in Deutsch: | Der Basidiomycete C. subvermispora produzierte in einem Bioreaktor 0.17 U/mL CDH. Das Enzym wurde durch Anionenaustausch-Chromatographie (DEAE Sepharose), hydrophobe Interaktions-Chromatographie (Phenyl Sepharose), und eine zweite Anionenaustausch-Chromatographie (MonoQ) gereinigt. Das Enzym wurde 43,6-fach gereinigt, die Ausbeute war 18.4% und die spezifische Aktivität 20.2 U/mg.
Die molekulare Masse der CDH war 96 kDa, die einer möglichen zweiten CDH-Form 66,6 kDa. Die IEF zeigte eine Doppelbande mit einem pH von 3,0 und 3,1. Das Spektrum der reduzierten und der oxidierten Form von CDH war typisch. Das mit dem DCIP Test gemessene Temperaturoptimum war 60°C, das mit dem Cytochrom c Test gemessene war 20°C. Die Aktivierungsenergie war 18,4 kJ/mol. Das pH-Optimum für CDH war pH 4,5 mit DCIP als Elektronenakzeptor. Mit Cytochrom c, 1,4-Benzochinon und Ferrocenium war es pH 3,5 und mit K3[Fe(CN)]6 unter pH 2,5.
Die KM Werte waren mit DCIP als Elektronenakzeptor 0,13 mM für Cellobiose und 4,4 mM für Laktose. Mit Cytochrom c als Elektronenakzeptor waren sie 0,08 mM für Cellobiose und 3,7 mM für Laktose. Die KM Werte für Glukose und Maltose waren 4150 mM und 216 mM. Cytochrom c und Ferrocenium zeigten niedrige KM Werte von 0,94 µM und 0.32 µM. DCIP, 1,4-Benzochinon und K3[Fe(CN)]6 hatten KM Werte die um das hundertfache höher waren als die der ersten beiden Elektronenakzeptoren.
Das für die CDH von M. thermophilum kodierende Gen wurde kloniert. Phylogenetische Untersuchungen der neu gefunden Sequenz und anderen CDH Sequenzen teilten die CDH in CDH von Basidomyceten und in CDH von Ascomyceten. Die Sekundärstruktur und die dreidimensional Struktur von M. thermophilum CDH wurde modelliert. | | Abstract in Englisch: | To produce CDH from C. subvermispora, the basidiomycete fungi was cultivated in a bioreactor. A volumetric activity of 0.17 U/mL was obtained and purified by exchange chromatography (DEAE Sepharose), hydrophobic interaction chromatography (Phenyl Sepharose), and a second anion exchange chromatography step (MonoQ). The enzyme was purified 43.6 fold to homogeneity from the extracellular medium with an overall yield of 18.4% and a specific activity of 20.2 U/mg.
The molecular mass of CDH, determined by SDS-PAGE, was 96 kDa. A band at 66.6 kDa implied another additional CDH-form. IEF showed a double band with a pI of 3.0 and 3.1, respectively. The spectrum of the reduced and the oxidised form of CDH was typical. The temperature optimum was 60°C, when measured with the DCIP assay, and 20°C, when measured with the cytochrome c assay. The activation energy was calculated to be 18.4 kJ/mol. The pH optimum with DCIP as electron acceptor was pH 4.5, with cytochrome c, 1,4-benzoquinone, and ferrocenium as the electron acceptor pH 3.5, and with K3[Fe(CN)]6 as the electron acceptor below pH 2.5.
The KM values were found to be 0.13 mM for cellobiose and 4.4 mM for lactose when DCIP was the electron acceptor and 0.08 mM for cellobiose and 3.7 mM for lactose when cytochrome c was the electron acceptor. The KM values were higher for glucose (4150 mM) and maltose (216 mM). The electron acceptors cytochrome c and ferrocenium exhibit low KM values of 0.94 µM and 0.32 µM. Higher KM values were found for DCIP (12.5 µM), 1,4-benzoquinone (26.9 µM) and K3[Fe(CN)]6 (10.9 µM).
The gene encoding the CDH of M. thermophilum was cloned and its sequence was used to calculate phylogenetic trees of the CDH protein sequence, which were divided into two classes, the ascomycete and the basidiomycete CDHs. Also, secondary protein structure prediction with PSIPRED and prediction of the three-dimensional structure was performed. | | Schlagworte | | Schlagwörter Deutsch: | Chemie:Biochemie Cellobiose Dehydrogenase Myriococcum thermophilum Ceriporiopsis subvermispora Bioinformatik | | Schlagwörter Englisch: | CHEMISTRY, BIOCHEMISTRY Cellobiose Dehydrogenase Myriococcum thermophilum Ceriporiopsis subvermispora Bioinformatics | | Sonstiges | | Signatur: | HB: D-12257 | | Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H75300 Abteilung Lebensmittelbiotechnologie (LBT) | |
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