| AutorIn | | Name: | DIPL.-ING. DR.NAT.TECHN. Daniel Kolarich | 1.Beurteilende(r)| Name: | Ao.Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.nat.techn. Friedrich Altmann | | Herkunftsbetrieb: | | | Arbeit | | Typ der Arbeit: | Dissertation | | Sprache der Arbeit: | Englisch | | Titel der Arbeit in Originalsprache: | Mass spectrometry based glyco-proteomic analysis of GMO food crops and allergens from plants and insects | | Titel der Arbeit in deutsch: | n.a. | | Titel der Arbeit in englisch: | Mass spectrometry based glyco-proteomic analysis of GMO food crops and allergens from plants and insects | | Publikationsmonat: | 11.2004 | | Seitenanzahl: | | | Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur | | AC-Nummer: | AC04349793 | | Abstract | | Abstract in Deutsch: | Eine in allen eukaryontischen Lebewesen häufig vorkommende posttranslationelle Modifizierung von Proteinen ist die N-Glykosylierung, bei der Oligosaccharide bestimmter Struktur und Zusammensetzung an spezifische Stellen innerhalb des Polypeptids angeknüpft werden. Diese Zuckerantennen spielen in unterschiedlichen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle, so unter anderem als kreuz-reaktive Determinanten (CCD) bei der Auslösung von allergischen Reaktionen gegen Allergenproteine aus Pflanzen und Insekten, da diese Säuger-untypische Strukturen wie core alpha1,3-Fucosen (und zusätzlich beta1,2-Xylosen in Pflanzen) enthalten können.
Daher war die glyko-proteomische Charakterisierung von einigen Pflanzen- und Insektenallergenen basierend auf "Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time Of Flight Mass Spectrometry" (MALDI TOF MS), MALDI Quadrupol TOF MS (MALDI Q-TOF MS) und nano "ElectroSpray Ionisation Quadrupol Time Of Flight Liquid Chromatography Tandem" MS (ESI Q-TOF LC-MSMS) ein Schwerpunkt dieser Arbeit. Als Teil eines Projekts in Zusammenarbeit mit dem Paul Ehrlich Institut in Deutschland wurden an Lyc e 2, einem Tomaten-Nebenallergen mit beta-Fructofuranosidase Aktivität, Strukturen identifiziert, die core alpha1,3-Fucosen und beta1,2-Xylosen enthielten und auch für eine Histaminfreisetzung mitverantwortlich waren. Letzteres konnte für Cor a 11, einem Nebenallergen in Haselnüssen, welches größtenteils "nur" mit beta1,2-Xylose modifizierte N-Glykane enthielt, nicht nachgewiesen werden. Bei Cor a 11 war nur eine der zwei möglichen N-Glykosylierungsstellen auch in vivo mit einem N-Glykan modifiziert.
Wespengift stellt für manche Allergiker eine tödliche Gefahr dar. Detaillierte Informationen über die drei Hauptallergene des Wespengifts auf Proteinebene sind eher spärlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die erste detaillierte glykomische und proteomische Analyse der drei Hauptallergene, Antigen 5, Phospholipase und Hyaluronidase, letzteres ein Glykoprotein, aus sechs unterschiedlichen Wespenarten durchgeführt. Bereits bekannte Proteinsequenzen konnten mit einigen Korrekturen bestätigt werden. Darüber hinaus war es für vier Arten möglich, mittels MSMS Sequenzen der dort bisher nicht untersuchten Phospholipase zu bestimmen. Zusätzlich wurde in der gemeinen Wespe (V. vulgaris) eine bisher vollkommen unbekannte, zumindest in fünf der sechs analysierten Wespenarten äußerst homologe und hauptsächlich vorkommende Form des Glykoproteins Hyaluronidase identifiziert. Die Isolierung von cDNA dieses Proteins erfolgte durch Primer, die auf Basis der de novo und der N-terminalen Sequenz erstellt wurden. Beide aus dieser Sequenz ermittelten potentiellen N-glykosylierungsstellen waren hauptsächlich mit am reduzierenden Ende difukosylierten N-Glykanen ausgestattet. Basierend auf MALDI Q-TOF MS und zweidimensionaler HPLC konnte die Struktur dieser N-Glykane zusätzlich durch die erste, jemals an Wespengift durchgeführte Glykosylierungsanalyse ermittelt werden. Der Großteil der identifizierten N-Glykane enthielt core alpha1,3-Fucosen, die Grundlage für kreuzreagierende Kohlenhydrat Determinanten (CCDs).
Im Rahmen von GMOCARE, einem von der Europäischen Kommission finanziertem Projekt mit dem Ziel, genetisch modifizierte Organismen (GMO) und deren Produkte nach Stand der Wissenschaft so umfassend und genau wie möglich zu charakterisieren, wurden Methoden zur Detektion, Identifizierung und Quantifizierung von Änderungen im Glykosylierungsmuster von GMOs entwickelt und bewertet. Die N-Glykane von unterschiedlich modifizierten und von Wildtyp Linien aus Erdäpfeln (Solanum tuberosum), Paradeisern (Lycopersicon esculentum) und Mausohrkresse (Arabidopsis thaliana) wurden erfolgreich isoliert und charakterisiert. Darüber hinaus war es möglich, von geringen Mengen gefriergetrocknetem Material (< 1000 mg) reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Nichtsdestotrotz wurde in keiner der analysierten Proben eine statistisch signifikante Änderung im N-Glykosylierungs-muster zwischen den Wildtyp und den GMO Pflanzen festgestellt. Die wahrscheinlichste Erklärung liegt darin, dass in keiner Probe die Modifizierung einen Einfluss auf den N-Glykosylierungsweg hatte. Bei der Analyse von mittels zweidimensionaler Elektrophorese aufgetrenntem Patatin, dem Hauptprotein der Erdäpfel, wurde kein Einfluss der N-Glykosylierung, die hauptsächlich aus MMXF³ bestand, auf das elektrophoretische Wanderungsverhalten festgestellt. Arabinogalactan-Proteine (AGP) wurden durch einen photometrischen Nachweis auf Basis des AGP-bindenden Yariv-Reagenzes quantifiziert. | | Abstract in Englisch: | N-glycosylation, a common eukaryotic post translational modification of proteins, is involved in numerous biological interactions. In particular N-glycans from plants and insects are, as a result of their capability of adding core alpha1,3-fucose (and additionally beta1,2-xylose in plants), of great interest since these sugars are involved in allergy as cross reactive carbohydrate determinants (CCD).
By glyco-proteomic methods based on matrix assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry (MALDI TOF MS) several plant and insect allergen proteins were characterised in detail. As part of a collaboration with the Paul Ehrlich Institute in Germany, Lyc e 2, a minor tomato allergen with beta-fructofuranosidase activity, was identified to carry primarily N-glycan structures with core aplha1,3-fucose and beta1,2-xylose (MMXF). A minor allergen in hazelnuts, Cor a 11, was demonstrated to carry predominantly only beta1,2-xylosylated N-glycans. Just one of the two potential N-glycosylation sites carried N-glycans, the other remained unmodified.
MALDI Quadrupole TOF MS (MALDI Q-TOF MS) and nano electrospray ionisation quadrupole time of flight liquid chromatography tandem MS (ESI Q-TOF LC-MSMS) were the key techniques in the detailed glycomic and proteomic investigation of the three major allergens from six species of yellow jackets (Vespula). Already known protein sequences could essentially be confirmed, however, with several variations in the amino acid sequence. For the four species where the phospholipase had not been previously described, protein sequences were determined by MSMS de novo sequencing, verifying the phospholipase nature of these proteins. In the common wasp (V. vulgaris) a novel, in at least five wasp species very homologous and predominant form of the glycoprotein hyaluronidase was identified. cDNA was generated based on de novo sequence tags and N-terminal sequencing. Both potential N-glycosylation sites predicted by this sequence were shown to bear difucosylated, small complex type N-glycans. The structural identity of the N-glycans was additionally confirmed by the first glycomic examination ever done on wasp venom N-glycans using MALDI Q-TOF MS and two dimensional HPLC. The majority of the identified N-glycans contained aplha1,3-fucose, a prerequisite for antibody binding.
As part of GMOCARE, a project initiated and funded by the European Commission intended to investigate the methodology for characterising genetically modified organisms (GMOs) and their products as comprehensive and explicit as current techniques allow it, methods for the detection, identification and quantitation of changes in the glycosylation pattern of GMOs were developed and evaluated. N-glycans from several modified and wild type lines of potatoes, tomatoes and Arabidopsis were successfully isolated and characterized. Even from small amounts of freeze dried material (< 1000 mg) reproducible results could be obtained. Nevertheless, no statistically significant changes in the N-glycan profile between wild type and GMO plants could be detected in any of the plants analyzed, neither by MS methods nor by HPLC of fluorescently labelled glycans. This may be due to the fact that the modifications in the GMO plants did not interfere with the N-glycosylation pathway. Besides, MMXF was identified as the major N-glycan being attached to 2D separated patatin-isoform spots. A potential influence of the N-glycosylation on the electrophoretic migration could not be observed for this main potato tuber protein. For comparing the content of arabino-galactan proteins a photometric method for the quantitation with the AGP-binding Yariv reagent was established. | | Schlagworte | | Schlagwörter Deutsch: | Chemie:Biochemie Glykobiologie Proteomics Glycomics tandem Massenspektrometrie | | Schlagwörter Englisch: | CHEMISTRY, BIOCHEMISTRY Proteomics Glycobiology Glycomics tandem mass spectrometry | | Sonstiges | | Signatur: | HB: D-11946 | | Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H77200 Institut für Biochemie (DCH/BC) | |
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