| AutorIn | | Name: | DIPL.-ING. DR.NAT.TECHN. Daniel Kolarich | Beurteilende(r)| Name: | Ao.Univ.Prof. Dipl.-Ing. Dr.nat.techn. Friedrich Altmann | | Herkunftsbetrieb: | | | Arbeit | | Typ der Arbeit: | Masterarbeit | | Sprache der Arbeit: | Deutsch | | Titel der Arbeit in Originalsprache: | Massenspektroskopische Analyse von elektrophoretisch aufgetrennten Glykoproteinen. Indentifizierung der N-Glykanstrukturender Allergene Ara H1 aus der Erdnuss, Ole e1 aus Olivenpollen und einem 50 kDa Haselnussallergen | | Titel der Arbeit in deutsch: | Massenspektroskopische Analyse von elektrophoretisch aufgetrennten Glykoproteinen : Identifizierung der N-Glykanstrukturen der Allergene Ara h1 aus der Erdnuss, Ole e1 aus Olivenpollen und einem 50 kDa Haselnussallergen | | Titel der Arbeit in englisch: | n.a. | | Publikationsmonat: | 09.2000 | | Seitenanzahl: | | | Online-Katalog der Universitätsbibliothek Bodenkultur | | AC-Nummer: | AC03069312 | | Abstract | | Abstract in Deutsch: | Diese Arbeit befaßt sich mit einer neuen Methode zur Identifizierung von N-Glykanen
eines SDS-PAGE Proteins mittels MALDI-TOF MS. Nach Identifizierung des Proteins durch
"tryptic peptide mass fingerprinting" wurden von den verbleibenden Peptiden mit Peptid-N-Glykosidase A
(PNGase A) die Glykane abgespalten und mit Hilfe von Mikrosäulen, bestehend aus einem
Kationenaustauscher- und einem Anionenaustauscherharz und einem Reversed Pahse Gel, für eine
anschließende MALDI-TOF MS Analyse aufgereinigt.
Mit dieser Methode, die im speziellen für core alpha1-3 Fucose enthaltende Glykoproteine,
wie sie in Pflanzen, Insekten und Parasiten vorkommen, etabliert wurde, war es aber durch geringfügige
Modifizierungen auch möglich, neuraminsäurehältige Glykoproteine aus Säugern zu analysieren.
Die Sensitivität und Anwendbarkeit der Mikromethode wurde mit Hilfe von Proteinen bekannter N-Glykanstruktur
wie der Zucchini Ascorbat Oxidase, dem Soja Lectin, der Kren Peroxidase, der Hyaluronidase und der Phospholipase
aus Bienengift und der Ribonuclease A bestätigt. Pmol-Mengen an Protein waren für eine eindeutige Identifizierung
der N-Glykane ausreichend. Für neuraminsäurehältige Proteine, wie dem Fetuin aus Rind, wurden die N-Glykane simultan
mit dem PNGase A-Verdau auch mit Sialidase behandelt, um die desialylierten Strukturen mittels MALDI-TOF MS ermittlen zu können.
Unterschiedliche Methoden zur Derivatisierung von Oligosacchariden mit 4-Aminobenzoesäure-2-(diethylamino)Ethylester (Procain) wurden
verglichen und lieferten weitgehend ähnliche Ausbeuten an derivatisierten Zuckern. Jedoch konnte die in der Literatur
beschriebene Empfindlichkeitssteigerung von Procain-derivatisierten Oligosacchariden für die MALDI-TOF MS nicht bestätigt werden.
Zur Verbesserung der massenspektroskopischen Analyse von Oligosacchariden kam neben 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) auch eine neue ternäre
Matrixmischung aus DHB, 1-Hydroxy Isoquinoline (HIC) und Arabinosazon (ARA) zur Verwendung, die teilweise deutlich bessere Ergebnisse erbrachte.
Anwendung fand diese Methode in der Identifizierung der bisher unbekannten N-Glykane des Hauptallergens der Erdnuss Ara h1, des Olivenpollens
Ole e1 und einem 50 kDa Haselnussallergen. Während Ara h1 neben mannosidischen nur xylosylierte N-Glykane mit MMX und M4X als Hauptstrukturen
trägt, wurden bei Ole e1 und dem Haselnussallergen auch fucosylierte Strukturen zweifelsfrei nachgewiesen. Bei Ole e1 war GnMX, bei dem 50 kDa
Haselnussallergen MMX die Hauptstruktur. | | Abstract in Englisch: | A new method has been established which allows the identification by MALDI-TOF MS of
N-glycans from SDS-PAGE seperated glycoproteins. After identification of the proteins
by tryptic peptide mass fingerprinting, the remaining peptides were treated with peptide-N-glycosidase A
(PNGase A) and N-glycans were isolated after passage of the digests through a 3-bed-microcolumn
consisting of a cation excange, an anion exchange and a reversed phase resin. Though this method has
primarily been designed for glycoproteins containing core alpha 1-3 fucosylated structures, it is, with minor changes,
also easy applicable to mammalian neuraminic-acid containing, glycoproteins.
When this micromethod was applied to glycoproteins of known glycan structure (zucchini ascorbic oxidase, soybean agglutinin,
horseradish peroxidase, ribonuclease B, bovine fetuin, bee venom hyaluronidase and phospholipase A2), the N-glycans could
clearly be identified. SDS-PAGE bands containing 4 ¿g of protein usually provided a sufficient amount of N-glycans for MALDI-TOF MS
analysis. For analysing mammalian glycoproteins such as bovine fetuin, the neuramininc acid-containing were treated with sialidase and
PNGase A simultaneously. The desialylated structures were identified by MALDI-TOF MS.
Different methods of derivatizing oligosaccharides with 4-aminobenzoic acid-2-(diethylamino) ethyl ester (Procain) had been tested
with similar yields in derivatizied sugars. Nevertheless, the 1000-fold increase in sensitivity for MALDI-TOF MS, suggested from
the literature, was not realised.
For improving the mass spectrometric analysis of oligosaccharides a new ternary matrix mixture consisting of 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB),
1-hydroxy isoquinoline and arabinosazone was successfully used in addition to the well-known DHB.
This method was utilised to identify previously uncharacterised N-glycans of serveral allergen glycoproteins: the major peanut
allergen Ara h1 was found to carry mainly xylosylated structures like MMX and M4X, whereas for the major olive pollen allergen Ole e1 GnMX
could be found as the main structure. A 50 kDa allergen from hazelnut contained MMX as the major N-glycan, but for Ole e1 and the
hazelnut allergen core alpha 1-3 fucosylated structures could be identified as well. | | Schlagworte | | Schlagwörter Deutsch: | Chemie:Biochemie Glykoprotein Elektrophorese MALDI-TOF MS N-Glykan | | Schlagwörter Englisch: | CHEMISTRY, BIOCHEMISTRY Electrophoresis MALDI-TOF MS N-Glycan Glycoprotein | | Sonstiges | | Signatur: | D-9750 | | Organisationseinheit, auf der die Arbeit eingereicht wird: | H60500 Inst.f. Chemie | |
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